第135期? 東曹色譜產(chǎn)品在質(zhì)粒DNA純化與分析中的應(yīng)用
?
質(zhì)粒（plasmid）是一種小型環(huán)狀DNA，在基因工程中常利用質(zhì)粒作為運(yùn)載體，將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)。雖然近年來(lái)開(kāi)發(fā)了不少更為先進(jìn)的基因轉(zhuǎn)移載體（如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體等），但質(zhì)粒載體由于制備簡(jiǎn)便以及在各類(lèi)細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染率，仍然被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用。
隨著基因治療的迅速發(fā)展，高純度的質(zhì)粒DNA的需求量越來(lái)越大。在純化質(zhì)粒DNA時(shí)，除了需要去除混入的蛋白質(zhì)、RNA、內(nèi)毒素和宿主基因組DNA等雜質(zhì)以外，還需要去除質(zhì)粒DNA的立體異構(gòu)體Open circular體（開(kāi)環(huán)狀質(zhì)粒）和Linear體（直鏈線狀質(zhì)粒），只對(duì)Supercoiled體（超螺旋狀質(zhì)粒）進(jìn)行純化。
?
質(zhì)粒的色譜分離模式
分離模式 | 分離方法 | 分離原理 | 去除雜質(zhì) | 純化步驟 |
尺寸排阻色譜 （SEC） | 等度分離 | 分子尺寸的差異 （質(zhì)粒分子較大，在排阻V0附近洗脫） | 延遲洗脫 | 初期粗純 精制 |
陰離子交換色譜 （AIEC） | 吸附/梯度洗脫 | 電荷的差異 （質(zhì)粒帶高負(fù)電荷） | 流穿或梯度 （質(zhì)粒異構(gòu)體分離） | 捕獲 中間步驟 精制 |
疏水色譜 （HIC） | 流穿 吸附/梯度洗脫 | 疏水性的差異 | 疏水性的差異 （質(zhì)粒異構(gòu)體分離） | 捕獲 中間步驟 |
Ref.: Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified
?
使用陰離子交換色譜分析質(zhì)粒DNA
基因治療實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒純度的檢測(cè)方法之一是測(cè)量開(kāi)環(huán)質(zhì)粒和超螺旋質(zhì)粒的相對(duì)量。下圖是采用陰離子交換色譜柱TSKgel DNA-NPR分析質(zhì)粒的譜圖。此款色譜柱采用無(wú)孔的親水聚合物基質(zhì)填料，表面由弱陰離子交換基團(tuán)改性，具有極高的蛋白回收率。適用于對(duì)DNA片段，PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒的高效分離。
質(zhì)粒的純化工藝步驟示例
在質(zhì)粒DNA的純化工藝中通常使用陰離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析。質(zhì)粒DNA與內(nèi)毒素相比，其疏水性非常低，所以使用疏水填料可以從質(zhì)粒DNA中有效去除內(nèi)毒素。
Ref.: S.Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified
?
使用Toyopearl Butyl-650S疏水填料純化質(zhì)粒
使用TSKgel和TOYOPEARL分離純化質(zhì)粒載體的應(yīng)用實(shí)例
分離模式 | 色譜柱 | 應(yīng)用 | 文獻(xiàn)名稱(chēng) |
SEC IEC,HIC | TSKgel ? G-DNA-PW、 G6000PWXL、 DNA-NPR、Butyl-NPR | 質(zhì)粒DNA | Characterization ? of Plasmid DNA Samples ?by ? Chromatographic Methods |
IEC | TSKgel ? DNA-NPR | 質(zhì)粒DNA | Separation ? of topological forms of plamid DNA by anion-exchange HPLC: Shifts in elution ? order of linear DNA |
SEC | TSKgel ? G-DNA-PW、 G6000PWXL | 質(zhì)粒DNA | High-speed ? chromatographic purification of plasmid DNA with a customized biporous ? hydrophobic adsorbent |
IEC | TSKgel ? DNA-NPR | 質(zhì)粒DNA | Effective ? and robust plasmid topology analysis and the subsequent characterization of ? the plasmid isoforms thereby observed |
分離模式 | 層析填料 | 應(yīng)用 | 文獻(xiàn)名稱(chēng) |
AFC | 精氨酸固定化 AF-Epoxy-650M | 超螺旋質(zhì)粒DNA | Effect ? of Chromatographic Conditions on Supercoiled Plasmid DNA Stability and ? Bioactivity |
HIC | Butyl-650M | 質(zhì)粒DNA | Improved ? downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy |
