第七十七期 TSKgel色譜柱在尺寸排阻色譜法分離多肽中的應(yīng)用

前 言

??? 采用高性能尺寸排阻色譜法（GFC或SEC）進(jìn)行多肽分離，操作簡便，不僅可用作檢測分子量的手段，還可作為純化多肽與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物如多肽片斷的方法之一。可與反相色譜法（RPC）及離子交換色譜法（IEC）聯(lián)用。同時(shí)，在臨床上還通過把GFC進(jìn)行比較，來推測病程的進(jìn)展。

??? 表1所示為TSKgel色譜柱在采用GFC法進(jìn)行多肽分離的相關(guān)文獻(xiàn)及其概要。

??? 各作者均對洗脫液進(jìn)行了細(xì)致的分離，明確了GFC法中使用的洗脫液對分離性能與分餾后處理會(huì)產(chǎn)生影響。一般情況下，采用GFC法分離多肽所使用的填充劑多為TSKgel的SW硅膠型填料而非TSKgel的PW樹脂型填料。

??? 本報(bào)告中，將針對這些填充劑（TSKgel G2000SWXL以及TSKgel G2500PWXL）在多肽分離的應(yīng)用上進(jìn)行探討。

實(shí)例應(yīng)用

1）標(biāo)準(zhǔn)多肽的分離

??? 表2所示為各多肽標(biāo)準(zhǔn)液的洗脫體積，圖1所示為標(biāo)準(zhǔn)曲線。洗脫液采用含有45%乙腈的0.1%TFA溶液。所有TSKgel G2000SWXL的樣品洗脫速度均慢于TSKgel G2500PWXL。同時(shí)，在TSKgel G2000SWXL中，肌球蛋白（MW17800）進(jìn)入填充劑的小孔內(nèi)部，但在TSKgel G2500PWXL中，肌球蛋白被小孔排阻，從外水體積中被洗脫。根據(jù)其結(jié)果，可認(rèn)為TSKgel G2500PWXL在上述洗脫液條件下的多肽分子量排阻界限推測為8000，相比之下，硅膠型填充劑TSKgel G2000SWXL，可適用于從低分子量到高分子量區(qū)域更廣的范圍。

??? 另一方面，如樣品分子量低于3000，TSKgel G2500PWXL顯示的標(biāo)準(zhǔn)曲線與TSKgel G2000SWXL幾乎趨于相同，分離范圍非常接近。但是，對比各多肽的洗脫體積，兩者尚存有微妙的區(qū)別（尤其是亮氨酸腦啡肽），這是由于在分離過程中樣品與填充劑之間的相互作用（離子性、疏水性的相互作用等）而造成的影響。

???

??? 圖2、3所示為TSKgel G2500PWXL與TSKgel G2000SWXL在分離多肽標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的對比圖。通過色譜圖可以明確的看出，TSKgel G2000SWXL吸收峰形與分離帶的寬度均更佳，因此其分離性能更為優(yōu)異。另一方面，如果多肽的分子量小于1000，由于樣品與填充劑之間的某些相互作用，使用TSKgel G2500PWXL時(shí)的分離效果要高于TSKgel G2000SWXL。例如圖2中所示的后葉催產(chǎn)素（MW1007）與亮氨酸-腦啡肽（MW555）、以及圖3所示的TRH（MW362）與甘氨酸（MW75）均顯示了其分離效果高于TSKgel G2000SWXL。

??? 如上所述，在整體上，TSKgel G2000SWXL具有更高的分離效果，但對于分子量低于1000的多肽樣品，TSKgel G2500PWXL的分離效果會(huì)更佳。另外，由于TSKgel SW型硅膠填充劑不具有耐堿性，如樣品需要在堿性條件下進(jìn)行分離，或使用NaOH溶液進(jìn)行色譜柱清洗時(shí)，請考慮使用TSKgel PW型色譜柱。

2）蛋白消化物的分離

????圖4所示為分離基因重組ProteinA的TRCK-胰蛋白酶消化物的實(shí)例。樣品中含有與蛋白質(zhì)消化物分子量不同的各類多肽。如上所示，由于TSKgel G2000SWXL色譜柱的分離范圍較寬，其分離效果也更好。（該樣品通過RPC分析的結(jié)果，可觀察到約有60種多肽峰在RPC下被檢測到）。

總 結(jié)

??? 表3所示為采用尺寸排阻色譜法進(jìn)行多肽分離時(shí)，TSKgel色譜柱產(chǎn)品的不同性能。一般考慮采用TSKgel G2000SWXL較為適合，但考慮到填充劑的耐堿性與多肽的分子量大小等因素，也可根據(jù)情況而選擇使用TSKgel G2500PWXL或TSKgel G3000PWXL。

*預(yù)估值

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